C’est quoi une culture cellulaire?

C’est quoi une culture cellulaire?
- C’est une technique de laboratoire pour faire vivre des cellules in vitro.
- C’est le prélèvement de cellule, d'un animal ou d'une plante et leur placement ultérieur dans un environnement artificiel conduisant à leur croissance.
- Le but est de multiplier des cellules ou de les maintenir vivantes pour les utiliser.

Dissociation mécanique et enzymatique

Culture cellulaire

Cas de la cellule végétale: Culture d’explant

• Un explant + un milieu de culture stérile+ un environnement favorable de croissance

Cas de la cellule végétale: Culture d’explant

Pourquoi mettre des cellules en culture?

- Matériel en grande quantité.
- Conservation des caractéristiques du tissu initial.
- Homogénéité des cellules.
- Contrôle de l’environnement et de traitements appliqués.
- Modèle pour l’étude de la physiologie cellulaire.
- Pour la production de:
  • Vaccins
  • Protéines thérapeutiques (anticorps, agents immunologiques,
    Hormones)
  • Tissus
  • Vecteurs viraux
  • Cellules souches

Types des cultures cellulaires:

1. Culture primaire.
2. Culture secondaire.
3. Culture de lignées cellulaires.

Culture primaire

Culture primaire

Dissociation mécanique et enzymatique

Avantages de culture primaire
- Proche de la "réalité" de la vie d'une cellule
Inconvénients
- Matériel en faible quantité
- Mélange de différents types cellulaires
- Ces cellules ne peuvent être maintenues en culture que pendant quelques générations

Culture secondaire

- Lorsque les cellules dans le récipient de culture primaire ont poussé et couvert tout le substrat de culture disponible (arrivent à confluence), elles doivent être décollées du support, dispersées et réensemencées à une densité plus faible dans un nouveau récipient de culture avec du

milieux frais. Cette opération est appelée: repiquage

Culture secondaire

- C’est une culture obtenue par repiquage à partir d’une culture primaire (ou d’une autre culture secondaire).

Lignée cellulaire

- Une lignée cellulaire est une population homogène de cellules, stables après des mitoses successives, et ayant en théorie une capacité illimitée de division (entretien in vitro par repiquages successifs).

- Il s'agit en général de:
 • Cellules cancéreuses, cellules prélevées sur une tumeur au départ
 • Cellules saines rendues immortelles (transformation = cancérisation) par traitement mutagène:
- chimique
- physique
- par utilisation de virus oncogènes

Une lignée peut être :
• à durée de vie limitée :on observe une dégénérescence (vieillissement) des cellules au bout d’un certain nombre de repiquages.
• à durée de vie illimitée: elle est alors appelée lignée continue.

Les sources de cellules

Deux sources de cellules sont possibles :
  1- Les cellules circulantes (en suspension)
- Indépendance vis-à-vis de l’ancrage
- Cellules mises en culture en suspension dans le milieu de culture (avec ou sans agitation)
(Exemple: Sang, moelle osseuse, liquides physiologiques).

2- Les cellules adhérentes à partir de tissus ou d'organes
 - Dépendance vis-à-vis de l’ancrage
 - Nécessité d’être attachées entre elles et ancrées sur un support pour survivre

Les milieux de culture

- Généralement constitués de:

• Récipients de cultures appropriés (en verre ou en plastique).

• Contenant un milieu qui apporte les nutriments essentiels à la survie et à

  la croissance.

- Le milieu de culture doit reproduire aussi fidèlement que possible les conditions

 de l’environnement que les cellules trouvaient in vivo:

• Apporter des éléments nutritifs.

• Contribuer au maintien des conditions physico-chimiques comme le pH

  et l’osmolarité.

• Permettre la prolifération des cellules (divisions cellulaires).

Milieu de culture minimum

C’est un milieu comportant les éléments chimiques (sous une forme utilisable)

strictement nécessaires à la croissance de la cellule:

- L’eau, indispensable à toute forme de vie (eau distillée stérile).

- Une source de carbone et d'énergie (le glucose).

- Une source d’azote.

- Des sels minéraux (K2HPO4 ou KH2PO4 ; MgSO4; MgCl2; CaCl2 …).

- Une source d’oligo-éléments (fer, zinc, manganèse, cuivre, cobalt, molybdène).

- Un pH constant (grâce au système tampon CO2/HCO3).

Milieu de culture empirique

- Il contient des composants indéfinis (des extraits de viande, des extraits de levures, peptones, des liquides biologiques ...).

- Une composition approximative.

- Ce sont des milieux très riches en substances organiques permettant une croissance aisée de nombreuses cellules.

Milieu de culture synthétique ou défini

- Milieu constitué de substances chimiques pures.

- La composition qualitative et quantitative est rigoureusement connue.

Quel milieu de culture utiliser?

- Il y a plus de 200 types cellulaires chez les animaux et les végétaux

 qui différent selon:

• La localisation anatomique

• L'état de différenciation

- Le choix du milieu de culture se fait en fonction du type cellulaire ou de l'expérience à réaliser.

Environnement de culture

Les paramètres à respecter:

- Température T= 37°

- Hygrométrie de 84 à 85 % d’humidité

- pH à 7.4 maintenu avec:

    • les tampons du milieu

    • l’atmosphère à 5% de CO2 dans l’étuve d’incubation

Matériel et instruments

PSM: Poste de Sécurité Microbiologique

- Ne pas introduire trop d'objets (perturbe le flux et la sécurité).

- Ne pas introduire d'objet poussiéreux (colmate les filtres).

- Ne pas effectuer de mouvements rapides à l'intérieur de l'enceinte stérile.

- Ne pas tousser, ni éternuer en direction de la zone stérile.

- Procéder à la désinfection alors qu'elle est toujours en marche.

- L'emploi de source de chaleur dans l'enceinte est interdite.

- Il est interdit d'introduire la tête dans la zone stérile.

Contaminations

Contaminants biologiques

- Bactéries.

- Levures/moisissures.

- Virus.

- Mycoplasmes.

Contaminants chimiques

- Endotoxines.

- Qualité du plastique.

- Reste de détergent.

- Trace d’aluminium.

- Résidus désinfectants.

Contamination croisée

- Autres cellules.

Techniques Aseptiques pour la culture cellulaire

•  Se laver les mains avant après.
•  Port de gants et blouse.
•  Cheveux attachés.
•  Nettoyage du plan de travail (Éthanol 70%, détergent désinfectant).
• Tout ce qui est en contact avec la culture doit être stérile (flasques, pipettes, tubes…).
• Nettoyer le matériel (mettre sous la hotte).