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mardi 24 mars 2015

C’est quoi une culture cellulaire?

C’est quoi une culture cellulaire?
- C’est une technique de laboratoire pour faire vivre des cellules in vitro
- C’est le prélèvement de cellule, d'un animal ou d'une plante et leur placement ultérieur dans un environnement artificiel conduisant à leur croissance
- Le but est de multiplier des cellules ou de les maintenir vivantes pour les utiliser
Culture cellulaire
Dissociation mécanique et enzymatique
Culture cellulaire

Culture cellulaire
Cas de la cellule végétale: Culture d’explant
Un explant + un milieu de culture stérile+ un environnement favorable de croissance
Milieu de culture
Cas de la cellule végétale: Culture d’explant
Milieu de culture
Pourquoi mettre des cellules en culture?
- Matériel en grande quantité
- Conservation des caractéristiques du tissu initial
- Homogénéité des cellules
- Contrôle de l’environnement et de traitements appliqués
- Modèle pour l’étude de la physiologie cellulaire
- Pour la production de:
  • Vaccins
  • Protéines thérapeutiques (anticorps, agents immunologiques,
    Hormones)
  • Tissus
  • Vecteurs viraux
  • Cellules souches
Types des cultures cellulaires :

  1. Culture primaire
  2. Culture secondaire
  3. Culture de lignées cellulaires


Culture primaire

culture primaire
Culture primaire
culture primaire
Dissociation mécanique et enzymatique
culture primaire

Avantages de culture primaire
- Proche de la "réalité" de la vie d'une cellule
Inconvénients
- Matériel en faible quantité
- Mélange de différents types cellulaires
- Ces cellules ne peuvent être maintenues en culture que pendant quelques générations
Culture secondaire
- Lorsque les cellules dans le récipient de culture primaire ont poussé et
couvert tout le substrat de culture disponible (arrivent à confluence),
elles doivent être décollées du support, dispersées et réensemencées à
une densité plus faible dans un nouveau récipient de culture avec du
milieux frais ----- Cette opération est appelée: repiquage
Culture secondaire
- C’est une culture obtenue par repiquage à partir d’une culture
 primaire (ou d’une autre culture secondaire)
culture secondaire

Lignée cellulaire
- Une lignée cellulaire est une population homogène de cellules, stables après des mitoses successives, et ayant en théorie une capacité illimitée de division (entretien in vitro par repiquages
 successifs)
- Il s'agit en général de:
 • Cellules cancéreuses, cellules prélevées sur une tumeur au départ
 • Cellules saines rendues immortelles (transformation = cancérisation) par traitement mutagène:
chimique
physique
par utilisation de virus oncogènes
Une lignée peut être :
• à durée de vie limitée :
on observe une dégénérescence (vieillissement) des cellules au bout d’un certain nombre de
repiquages
• à durée de vie illimitée: elle est alors appelée lignée continue
culture cellulaire
Les sources de cellules
Deux sources de cellules sont possibles :
  1- Les cellules circulantes (en suspension )
- Indépendance vis-à-vis de l’ancrage
- Cellules mises en culture en suspension dans le milieu de culture (avec ou sans agitation)
(Exemple: Sang, moelle osseuse, liquides physiologiques)
2- Les cellules adhérentes à partir de tissus ou d'organes
 - Dépendance vis-à-vis de l’ancrage
 - Nécessité d’être attachées entre elles et ancrées sur un support pour survivre
Les milieux de culture
- Généralement constitués de:
• Récipients de cultures appropriés (en verre ou en plastique)
• Contenant un milieu qui apporte les nutriments essentiels à la survie et à
  la croissance
- Le milieu de culture doit reproduire aussi fidèlement que possible les conditions
 de l’environnement que les cellules trouvaient in vivo:
• Apporter des éléments nutritifs
• Contribuer au maintien des conditions physico-chimiques comme le pH
  et l’osmolarité
• Permettre la prolifération des cellules (divisions cellulaires)
Milieu de culture minimum
C’est un milieu comportant les éléments chimiques (sous une forme utilisable)
strictement nécessaires à la croissance de la cellule:
- L’eau, indispensable à toute forme de vie (eau distillée stérile)
- Une source de carbone et d'énergie (le glucose)
- Une source d’azote
- Des sels minéraux (K2HPO4 ou KH2PO4 ; MgSO4; MgCl2; CaCl2 …)
- Une source d’oligo-éléments (fer, zinc, manganèse, cuivre, cobalt, molybdène)
- Un pH constant (grâce au système tampon CO2/HCO3)
Milieu de culture empirique
- Il contient des composants indéfinis (des extraits de viande, des extraits de levures, peptones, des liquides biologiques ...)
- Une composition approximative
- Ce sont des milieux très riches en substances organiques permettant une croissance aisée de nombreuses cellules
Milieu de culture synthétique ou défini
- Milieu constitué de substances chimiques pures
- La composition qualitative et quantitative est rigoureusement connue.
Quel milieu de culture utiliser?
- Il y a plus de 200 types cellulaires chez les animaux et les végétaux
 qui différent selon:
• La localisation anatomique
• L'état de différenciation
- Le choix du milieu de culture se fait en fonction du type cellulaire
ou de l'expérience à réaliser
milieu de culture
Environnement de culture
Les paramètres à respecter:
- Température T= 37°
- Hygrométrie de 84 à 85 % d’humidité
- pH à 7.4 maintenu avec:
    • les tampons du milieu
    • l’atmosphère à 5% de CO2 dans l’étuve d’incubation
Matériel et instruments
Matériel et instruments

Matériel et instruments

Matériel et instruments
Matériel et instruments

PSM: Poste de Sécurité Microbiologique
- Ne pas introduire trop d'objets (perturbe le flux et la sécurité)
- Ne pas introduire d'objet poussiéreux (colmate les filtres)
- Ne pas effectuer de mouvements rapides à l'intérieur de l'enceinte stérile
- Ne pas tousser, ni éternuer en direction de la zone stérile
- Procéder à la désinfection alors qu'elle est toujours en marche
- L'emploi de source de chaleur dans l'enceinte est interdite
- Il est interdit d'introduire la tête dans la zone stérile
Contaminations
Contaminants biologiques
- Bactéries
- Levures/moisissures
- Virus
- Mycoplasmes
Contaminants chimiques
- Endotoxines
- Qualité du plastique
- Reste de détergent
- Trace d’aluminium
- Résidus désinfectants
Contamination croisée
- Autres cellules
Techniques Aseptiques pour la culture cellulaire
  •  Se laver les mains avant après.
  •  Port de gants et blouse
  •  Cheveux attachés
  •  Nettoyage du plan de travail (Éthanol 70%, détergent désinfectant )
  • Tout ce qui est en contact avec la culture doit être stérile (flasques, pipettes, tubes…)
  • Nettoyer le matériel (mettre sous la hotte)
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